First of all, we thank the author for evaluating our article.1 As the author and we pointed out in our article, the Forkhead box P3 (FOXP3) gene is on the X chromosome. As far as we know, ten different reports in the literature have investigated the association between FOXP3 polymorphisms and the development of Graves’ disease (GD).2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 Seven of those reports presented the genotype and allele frequencies by pooling both sexes,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and the rest stratified the participants by sex and reported the genotype and allele frequencies separately in females and males.9, 10, 11 In our article, we aimed to evaluate the frequency of FOXP3 polymorphisms in GD with or without ophthalmopathy in a Turkish population.1 Since the number of participants in each group was limited in our study and there were no corrections for the previously published articles,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 we did not stratify the groups by sex and used the results of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) directly to analyze genotype and allele frequencies.1 In the PCR-RFLP method, the results were shown by band patterns and those patterns do not indicate whether the sample had one or two alleles of the gene of interest. Additionally, using the same analysis method, we could compare our results with those seven reports that did not stratify the groups by sex.
However, as mentioned by the author, as males have one and females have two X chromosomes, the genotypic patterns differ between the two sexes. There are three genotypes (two homozygotes and one heterozygote) in females but only two hemizygous genotypes in males. Therefore, it will be better to stratify the groups by sex and define the genotype and allele frequencies separately in females and males for X-linked genes. Moreover, the author emphasized the importance of comparing the observed and expected genotypic values based on Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) in his letter and explained the formula for an X-linked polymorphic locus. According to the concerns reported by the author, in this reply, we reported our additional analysis by stratifying the groups by sex as shown in Tables 1, 2, 3, and 4.
Firstly, we did the HWE analysis in both the controls and study groups, as suggested by the author. The frequencies of the observed genotypes were not significantly different from their expected frequencies based on HWE for all single nucleotide polymorphisms (SNPs) in female control groups (rs3761547, p=0.926; rs3761548, p=0.881; and rs3761549, p=0.926).
Secondly, when the groups were stratified by sex, we found that the frequency of the AC and AA genotypes of -3279 (rs3761548) and the CT genotype of -2383 (rs3761549) were significantly increased in our female study group (Table 1). Additionally, the A allele of -3279 had a significantly increased frequency both in the female (Table 1) and male study groups (Table 3) when compared separately or when compared between controls and patients regardless of sex (Table 4). The frequency of the T allele of -2383 was significantly increased both in our female study group when compared separately (Table 1) and in the whole study sample when compared regardless of sex (Table 4). However, the frequency of the T allele of -2383 was not significantly increased in our male study group when compared separately (Table 3). For polymorphism -3449 (rs3761547), allele and genotype frequency distribution were not significantly different in any comparisons between the control and study groups (Table 1, Table 3, and Table 4).
Thirdly, comparing the genotypic and allelic distributions of each of the three FOXP3 SNPs between female patients with Grave’s ophthalmopathy (GO) and GD without ophthalmopathy (non-GO) showed no statistically significant difference (Table 2).
Consequently, the results in our published article and the analysis made by stratifying the participants by sex were similar. However, as the author emphasized in his letter, polymorphic loci on X-chromosome should be analyzed differently than the loci on autosomal chromosomes. Therefore, his letter and our reply will be helpful for researchers who will investigate associations with X-linked polymorphic loci.
Öncelikle makalemizi değerlendirdiği için yazara teşekkür ederiz.1 Hem yazar tarafından hem de yazımızda belirtildiği üzere Forkhead box P3 (FOXP3) geni X kromozomu üzerinde yer almaktadır. Bildiğimiz kadarıyla, literatürdeki on farklı çalışmada, FOXP3 polimorfizmleri ile Graves hastalığı (GH) gelişimi arasındaki ilişki araştırılmıştır.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 Bu raporlardan yedisi her iki cinsiyeti bir arada değerlendirerek genotip ve allel frekanslarını sunmuş,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ve geri kalan çalışmalar ise hastaları cinsiyete göre gruplandırarak genotip ve allel frekanslarını kadınlar ve erkekler için ayrı ayrı bildirmiştir.9, 10, 11 Makalemizde, Türk popülasyonunda oftalmopati görülen ve görülmeyen GH’de FOXP3 polimorfizmlerinin frekanslarını değerlendirmeyi amaçladık.1 Çalışmamızda her gruptaki hasta sayısı sınırlı olduğu ve daha önce yayımlanan makalelere herhangi bir düzeltme olmadığı için,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 grupları cinsiyete göre sınıflandırmadık ve polimeraz zincir reaksiyonu-restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi (PCR-RFLP) sonuçlarını doğrudan genotip ve allel frekanslarını analiz etmek için kullandık.1 PCR-RFLP yönteminde, sonuçlar bant paternleri şeklinde görünür ve bu paternler, örnekte ilgili genin bir veya iki allele sahip olup olmadığını göstermezler. Ek olarak, aynı analiz yöntemini kullanarak, sonuçlarımızı grupları cinsiyete göre sınıflandırmayan yedi raporla karşılaştırma imkanı bulduk.
Ancak, yazarın belirttiği gibi, erkekler bir ve kadınlar iki X kromozomuna sahip olduğundan, genotip paternleri iki cinsiyet arasında farklılık göstermektedir. Kadınlarda üç genotip (iki homozigot ve bir heterozigot), erkeklerde ise sadece iki hemizigot genotip bulunmaktadır. Bu nedenle, grupların cinsiyete göre sınıflandırılması ve X’e bağlı genler için kadın ve erkeklerde ayrı ayrı genotip ve allel frekanslarının hesaplanması yararlı olacaktır. Ayrıca yazar mektubunda Hardy-Weinberg dengesine (HWD) dayalı gözlenen ve beklenen genotip frekans değerlerinin karşılaştırılmasının önemini vurgulamış ve X’e bağlı polimorfik lokus için formülünü açıklamıştır. Yazar tarafından bildirilen endişelere yanıt vermek adına, bu yanıtta, Tablo 1, 2, 3 ve 4’te gösterildiği gibi grupları cinsiyete göre sınıflandırarak ek analizler yaptık.
İlk olarak, yazarın önerdiği gibi hem kontrol hem de çalışma gruplarında HWD analizi yaptık. Gözlenen genotiplerin frekansları, kadın kontrol gruplarındaki tüm tek nükleotit polimorfizmleri (TNP) için HWD’ye göre beklenen genotip frekanslarından anlamlı farklı değildi (rs3761547, p=0,926; rs3761548, p=0,881; ve rs3761549, p=0,926).
İkinci olarak, gruplar cinsiyete göre sınıflandırıldığında, kadın çalışma grubumuzda -3279’un (rs3761548) AC ve AA genotipleri ve -2383’ün (rs3761549) CT genotipinin sıklığının anlamlı düzeyde arttığını bulduk (Tablo 1). Ek olarak, -3279 A alleli, hem kadın (Tablo 1) hem de erkek çalışma gruplarında (Tablo 3) ayrı ayrı karşılaştırıldığında veya cinsiyetten bağımsız olarak kontroller ve hastalar arasında karşılaştırıldığında (Tablo 4) anlamlı düzeyde artmıştır. T alleli -2383 frekansı, ayrı ayrı karşılaştırıldığında kadın çalışma grubumuzda (Tablo 1) ve cinsiyetten bağımsız olarak karşılaştırıldığında tüm çalışma örnekleminde anlamlı düzeyde artmıştır (Tablo 4). Ancak ayrı ayrı karşılaştırıldığında T alleli -2383 frekansı erkek çalışma grubumuzda anlamlı artış göstermemiştir (Tablo 3). Polimorfizm -3449 (rs3761547) allel ve genotip frekans dağılımı, kontrol ve çalışma grupları arasındaki herhangi bir karşılaştırmada anlamlı farklılık göstermedi (Tablo 1, Tablo 3 ve Tablo 4).
Üçüncü olarak, üç FOXP3 TNP’sinin her birinin Graves oftalmopatisi (GO) görülen ve oftalmopati görülmeyen (GO görülmeyen) GH’li kadın hastalar arasındaki genotip ve allel dağılımları karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu (Tablo 2).
Sonuç olarak, yayımlanan makalemizdeki sonuçlar ile katılımcıları cinsiyete göre gruplandırarak yapılan analiz sonuçları benzerdi. Ancak, yazarın mektubunda vurguladığı gibi, X-kromozomundaki polimorfik lokuslar, otozomal kromozomlardaki lokuslardan farklı olarak analiz edilmelidir. Bu nedenle, yazmış olduğu mektup ve ona yanıtımız, X’e bağlı polimorfik lokuslarla ilişkileri araştıracak araştırmacılar için yararlı olacaktır.
