Dear Editor,

It was with great interest that I read the article by Yaylacıoğlu Tuncay et al.¹ entitled “The role of FOXP3 polymorphisms in Graves’ disease with or without ophthalmopathy in a Turkish population” recently published in the Turkish Journal of Ophthalmology. The authors compared three FOXP3 polymorphisms (rs3761549, rs3761548 and rs3761547) between Graves’ disease patients with or without ophthalmopathy and between Graves’ disease patients and controls.

As mentioned by the authors, the forkhead box P3 (FOXP3, MIM: 300292) gene has been mapped to human chromosome Xp11.23. Considering that males and females have one and two X chromosomes, respectively, the genotypic patterns are quite different between the two sexes. Females have three genotypes (including two homozygotes and one heterozygote) and males have only two hemizygous genotypes. Therefore, it is impossible to pool the genotypes of the sex groups. Unfortunately, the authors made a fatal mistake by pooling the genotypes of both sexes. I have already discussed this point in a debate.² However, I think it is necessary to explain the following points: 1) how we should estimate allele frequencies, and 2) how we should make statistical comparisons in case-control studies for such loci.

According to the STrengthening the REporting of Genetic Association studies statement, in genetic association studies, researchers should compare the observed and expected genotypic values based on Hardy-Weinberg equilibrium (HWE).³

Suppose we have two alleles A₁ and A_2, at an X-linked polymorphic locus. If the frequencies of A₁A₁, A₁A₂, and A₂A₂ genotypes in females are “a”, “b” and “c”, respectively, and the frequencies of A₁ and A₂ hemizygous genotypes in males are “d” and “e”, then the allele frequency can be calculated by the counting method. The number of females and males is equal to n₁ (=a+b+c) and n₂ (=d+e), respectively.

The allele frequencies of A₁ and A₂ are denoted by p and q, respectively, and are estimated using the following formulas:

p=(2a+b+d)/(2n₁+n₂)

q=(b+2c+e)/(2n₁+n₂)

Then, the expected values for the A₁A₁, A₁A₂, and A₂A₂ genotypes in the female samples, calculated using the estimated p and q, are equal to p2, 2pq, and q2, respectively. Finally, the observed and expected values for the genotypes should be compared using the chi-squared test. The degree of freedom is 1.

Because the number of X chromosomes differs between the sexes of the participants, to compare cases with controls (in case-control studies), participants should be stratified by sex. However, when allelic frequency is estimated in the manner described above, it is possible to compare allelic frequencies (and not genotypic frequencies) between all cases and controls, regardless of their sex.

Considering that Yaylacıoğlu Tuncay et al.¹ included both sexes among their participants, the reported results should be interpreted with caution. It is recommended that the authors present their data on the genotypes of each polymorphism according to the sex of the participants and reanalyze their data to address the major issues mentioned above. As emphasized elsewhere,^{3, 4, 5} the researchers should also show that the frequencies of the observed genotypes are not significantly different from their expected frequencies based on HWE. I wish the esteemed authors all the best in their research.

Sayın Editör,

Yaylacıoğlu Tuncay ve ark.’nın¹ yakın zamanda Türk Oftalmoloji Dergisi’nde yayımlanan “Oftalmopati Eşlik Eden ve Etmeyen Graves Hastalığında FOXP3 Polimorfizmlerinin Türk Popülasyonundaki Rolü” başlıklı makalesini büyük bir ilgiyle okudum. Yazarlar, oftalmopati görülen veya görülmeyen Graves hastalarını ve Graves hastaları ve kontrolleri üç FOXP3 polimorfizmi (rs3761549, rs3761548 ile rs3761547) açısından karşılaştırmıştır.

Yazarların belirttiği gibi, forkhead box P3 (FOXP3, MIM: 300292) geninin insan kromozomu Xp11.23’de yer aldığı bilinmektedir. Erkeklerin ve kadınların sırasıyla bir ve iki X kromozomuna sahip olduğu göz önüne alındığında, genotipik paternler iki cinsiyet için oldukça farklıdır. Kadınların üç genotipi varken (iki homozigot ve bir heterozigot ) ve erkeklerin sadece iki hemizigot genotipi bulunmaktadır. Bu nedenle cinsiyet gruplarının genotiplerini bir araya getirmek imkansızdır. Ne yazık ki, yazarlar her iki cinsiyetin genotiplerini bir araya getirerek önemli bir hata yapmışlardır. Bu nokta tarafımdan daha önce tartışılmıştır.² Ancak, aşağıdaki noktaları açıklamanın gerekli olduğunu düşünüyorum: 1) Allel frekanslarını nasıl tahmin etmeliyiz? ve 2) bu tür lokuslarda olgu-kontrol çalışmalarında istatistiksel karşılaştırmaları nasıl yapmalıyız?

Genetik İlişkilendirme Çalışma Raporlarının Güçlendirilmesi (“STrengthening the REporting of Genetic Association studies”) yönergesine göre, genetik ilişkilendirme çalışmalarında, araştırmacılar Hardy-Weinberg dengesine (HWD) dayanarak gözlemlenen ve beklenen genotipik değerleri karşılaştırmalıdır.³

X’e bağlı bir polimorfik lokusta iki A₁ ve A₂ allel olduğunu varsayalım. Kadınlarda A₁A₁, A₁A₂ ve A₂A₂ genotiplerinin frekansları sırasıyla “a”, “b” ve “c” ve erkeklerde A₁ ve A₂ hemizigot genotiplerinin frekansları “d” ve “e” ise allel frekansı sayma yöntemi ile hesaplanabilir. Kadın ve erkek sayısı sırasıyla n₁ (=a+b+c) ve n₂ (=d+e)’ye eşittir. A₁ ve A₂ allel frekansları sırasıyla p ve q ile gösterilir ve aşağıdaki formüller kullanılarak tahmin edilir:

p=(2a+b+d)/(2n₁+n₂)

q=(b+2c+e)/(2n₁+n₂)

Daha sonra, kadın örneklerinde tahmin edilen p ve q kullanılarak hesaplanan A₁A₁, A₁A₂, ve A₂A₂ genotipleri için beklenen değerler sırasıyla p2, 2pq ve q2’ye eşit olur. Son olarak, genotipler için gözlemlenen ve beklenen değerler ki-kare testi kullanılarak karşılaştırılmalıdır. Serbestlik derecesi 1’dir.

Cinsiyetler arasında X kromozomlarının sayısı farklılık gösterdiğinden, olguları kontrollerle karşılaştırmak için (olgu-kontrol çalışmalarında) katılımcılar cinsiyete göre sınıflandırılmalıdır. Bununla birlikte, allelik frekans yukarıda açıklanan şekilde tahmin edildiğinde, cinsiyetten bağımsız olarak tüm olgu ve kontroller arasında allelik frekansları (genotipik frekansları değil) karşılaştırmak mümkündür.

Yaylacıoğlu Tuncay ve ark.’nın¹ çalışmasına her iki cinsiyetten bireylerin dahil edildiği göz önüne alındığında, bildirilen sonuçların dikkatle yorumlanması gerekir. Yazarların, her polimorfizmin genotipleri hakkındaki verilerini cinsiyete göre sunmaları ve yukarıda belirtilen önemli noktaları ele alarak verilerini yeniden analiz etmeleri önerilir. Daha önce bildirildiği üzere,^{3, 4, 5} araştırmacılar ayrıca gözlemlenen genotiplerin frekanslarının HWD’ye göre beklenen frekanslarından anlamlı düzeyde farklı olmadığını göstermelidir. Değerli yazarlara araştırmalarında başarılar diliyorum.