Öz

Amaç

Tavşanlarda sütür ile indüklenmiş kornea neovaskülarizasyonunda (KNV), bevacizumab ile yeni bir potansiyel biyobenzer bevacizumabın (anti-human VEGF GU01) antianjiyogenik etkilerini karşılaştırmak.

Gereç ve Yöntem

On beş tavşanın sağ göz kornealarının stromalarına 7-0 siyah ipek sütür yerleştirilerek KNV indüklendi (süperior limbustan 1-1,5 mm mesafeden ve 3 mm genişlikte). Yedinci günde, sütürler kaldırıldıktan sonra, tavşanlar randomize olarak 3 gruba ayrıldı: 1. gruptaki 5 göze 0,1 mL dengeli tuz solüsyonu (kontrol grubu), 2. gruptaki 5 göze 0,1 mL/2,5 mg bevacizumab (bevacizumab grubu), 3. gruptaki 5 göze 0,1 mL/2,5 mg anti-human VEGF GU01 (biyobenzer bevacizumab grubu) enjeksiyonları, subkonjonktival olarak uygulandı. KNV alanını analiz etmek için, sütür uygulaması sonrası 7. (enjeksiyon öncesi) ve 14. (enjeksiyondan 7 gün sonra) günlerde ameliyat mikroskobu yardımıyla standart görüntüler kaydedildi. Korneadaki neovasküler alan ImageJ programı yardımıyla, milimetre kare cinsinden hesaplandı. On dördüncü günde, bütün hayvanlar sakrifiye edildikten sonra, sağ göz kornea örnekleri hematoksilen-eozin boyası ile histopatolojik olarak analiz edildi.

Bulgular

Enjeksiyonlar sonrası yedinci günde, bevacizumab ve biyobenzer bevacizumab gruplarında, KNV alanlarının azalma oranlarının, kontrol grubuna göre anlamlı şekilde daha fazla olduğu izlendi (kontrol: %24,6, bevacizumab: %82,2, biyobenzer: %83,4; p<0,05). Bevacizumab ve biyobenzer bevacizumab gruplarında, KNV azalma oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark izlenmedi (p>0,05).

Sonuç

Bu deneysel çalışmada, bevacizumabın potansiyel biyobenzeri olan anti-human VEGF GU01’in KNV tedavisinde subkonjonktival bevacizumab kadar etkili olduğu bulunmuştur.

Giriş

Korneanın saydamlığını koruması net görme için en önemli etmenlerden biridir.¹ Stres ve oksijen eksikliği gibi bazı nedenlerle (enfeksiyon, enflamasyon, iskemi, dejenerasyon, travma veya limbal kök hücre eksikliği) patolojik kan damarları kornea boyunca büyüyebilmekte ve korneanın damarlanarak saydamlığını yitirmesine neden olabilmektedir. Bu duruma korneal neovaskülarizasyon (KNV) adı verilmektedir.²

KNV tedavisinde farklı derecelerde başarı sağlayabilen cerrahi ve medikal yöntemler kullanılmaktadır.^{3, 4} Bu tedavilerin amacı hem yeni damar oluşumunu önlemek (altta yatan etiyoloji ve patofizyolojiye odaklanarak) hem de oluşmuş patolojik damarların regresyonunu sağlamaktır.⁵ Damar gelişiminde önemli rolü olan vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) KNV oluşumunda önemli bir rolü olduğu ve VEGF inhibisyonunun bu durumu azaltabileceği gösterilmiştir.⁶

Günümüzde KNV tedavisinde denenmiş veya kullanılmakta olan ranibizumab (Lucentis; Genentech, ABD), bevacizumab (Avastin; Genentech, ABD) ve aflibercept (EYLEA; Bayer, Almanya) gibi iyi bilinen bazı anti-VEGF ajanlar bulunmaktadır.⁷ Bu ajanlardan bevacizumabın topikal veya subkonjonktival uygulaması endikasyon dışı olmasına rağmen KNV’yi azaltmada en sık kullanılan ajanlardan biridir.⁸ Diğer anti-VEGF’ler KNV tedavisinde etkili olsalar da yüksek maliyetlerinden dolayı sık tercih edilmemektedir. Anti-VEGF ajanlara erişimi kolaylaştırmak için biyobenzer moleküller geliştirilmeye başlanmıştır.^{9, 10} Üniversitemizin immünoloji laboratuvarında da bu amaçla bevacizumabın potansiyel bir biyobenzeri olan yeni bir monoklonal VEGF antikoru (anti-human VEGF GU01) geliştirme çalışması yürütülmektedir (bu ajan Bilim Sanayi ve Teknoloji Bakanlığı tarafından proje no: 0192-SanTez-2013-1 projesi kapsamında desteklenmiştir).¹¹ Anti-human VEGF GU01, hibridoma yöntemi ile, HiTrap Protein G HP klonu kullanılarak Fast Protein Liquid Chromatography cihazında saflaştırılmış, fare kökenli monoklonal immünoglobulin G antikorudur.¹¹

Çalışmamızın amacı, anti-human VEGF GU01 ajanının KNV’yi azaltmada etkisini değerlendirmektir.

Gereç ve Yöntem

Çalışmamızın onayı Gazi Üniversitesi Hayvan Bakımı Etik Komitesi’nden alındı (proje no: G.Ü.ET-15.025, tarih: 17/4/2015). Çalışmamız için ağırlıkları 2,5 ila 3 kg arasında olan 15 sağlıklı ve genç Yeni Zelanda tavşanı kullanıldı.

İşlemler öncesinde gözlere topikal proparakain HCl %0,5 (Alcaine; Alcon, ABD) damlatıldı. On beş tavşanın sağ gözüne genel anestezi altında (intramusküler ketamin [50 mg/kg] ve ksilazin [5 mg/kg]) 7,0 siyah ipek sütürler cerrahi mikroskop altında atıldı. Sütürler, üst limbustan santrale doğru, orta stromal düzeyde, 1-1,5 mm uzunluğunda ve 3 mm genişliğinde olacak şekilde aynı araştırmacı tarafından (M.C.Ö.) yerleştirildi. Enfeksiyon profilaksisi için gözlere bir hafta boyunca günde iki kez topikal moksifloksasin (Vigamox, Alcon, Fort Worth, Teksas, ABD) göz damlası uygulandı. Yedinci günün ardından, KNV’nin tüm gözlerde yeterli oranda oluştuğu izlendi ve genel anestezi altında sütürler çıkarıldı.

Sütürler çıkarıldıktan sonra, 15 tavşan rastgele olarak üç gruba ayrıldı. Kontrol grubuna 0,1 mL dengeli tuz solüsyonu; bevacizumab grubuna 0,1 mL/2,5 mg bevacizumab (Avastin; Genentech, ABD) (4 mL/100 mg); biyobenzer grubuna 0,1 mL/2,5 mg anti-human VEGF GU01 (Gazi Üniversitesi İmmünoloji Laboratuvarı; Ankara, Türkiye) (0,4 mL/10 mg), subkonjonktival olarak uygulandı (Tablo 1). Enjeksiyonlar üst kadrandan, limbustan 1 mm uzaklıktan 30 gauge iğne ile uygulandı (M.C.Ö.).

Görüntülemeler için bir ameliyat mikroskobu (Möller-Wedel FS 3000, Haag Streit, Almanya) ve ona monte edilmiş bir kayıt sistemi (Avermedia software, Tayvan) kullanıldı. 16x’lik büyütmede görüntülenen KNV alanı yedinci (enjeksiyon öncesi) ve on dördüncü günlerde (enjeksiyondan 7 gün sonra) ImageJ programı (Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institutes of Health, Bethesda, MD, ABD) kullanılarak milimetre kare cinsinden hesaplandı. Alan hesaplamalarından önce standardizasyon için, ameliyat mikroskobu ile 16x’lik büyütmede çekilen bir cetvel fotoğrafı kullanıldı. ImageJ programına yüklenen standart cetvel görüntüsü üzerine çizilen 1 mm uzunluğundaki bir çizgi, programın numerik analizleri için 1 mm olarak uygulamaya kaydedildi. Fotoğraflardaki neovasküler bölge uygulama imleci yardımıyla çevrelendi. Numerik değerlendirmeler için tedavi öncesi hesaplanan KNV alanları %100 olarak kabul edildi. Tedavilerden 1 hafta sonra KNV alanlarının yüzde olarak ne kadar azaldığı hesaplandı. Bu ölçümler tedavi grubuna kör araştırmacı (A.Ö.) tarafından gerçekleştirildi. Sonrasında tüm hayvanlar sakrifiye edilerek sağ gözlere enükleasyon uygulandı. Limbus bölgesi sağlam bırakılarak KNV bölgesinin bulunduğu kornea bölgeleri eksize edildi. Alınan dokuların yarısı histopatolojik değerlendirme için hematoksilen-eozinle boyanmak üzere 24 saat formaldehitte tutularak parafine gömüldü. Dokuların diğer yarıları endotel hücresi belirteci olan CD31 boyası ile immünohistokimyasal inceleme için immünoloji laboratuvarına yollandı. 4 mikronluk kesitlerle hazırlanan örnekler mikroskopta 200’lük büyütmede fotoğraflanarak değerlendirildi.

İstatistiksel Analiz

Çalışmada örneklem büyüklüğü belirlenirken, alandaki benzer deneysel modellerde kullanılan hayvan sayıları referans alınmış; çalışma öncesinde güç analizi yapılmamıştır. İstatistiksel analizler için SPSS programı (versiyon 22, IBM, ABD) kullanıldı. Verilerimizin dağılımı ve örneklem sayısı parametrik analizler için yeterli olmadığından, tedavi öncesi ve sonrası alan karşılaştırmaları için Kruskal-Wallis testi, tedavi sonrası KNV alanı regresyon oranlarını karşılaştırmak için Mann-Whitney U testi kullanıldı. p<0,05 değerler anlamlı olarak kabul edildi.

Bulgular

Sütürasyondan sonraki 7. günde, tüm gözlerde yeterli oranda KNV’nin oluştuğu izlendi. Kontrol, bevacizumab ve biyobenzer gruplarında hesaplanan ortalama KNV alanları sırasıyla 2,59±0,34 mm², 2,37±0,40 mm² ve 2,36±0,44 mm² idi. Gelişen KNV alanları arasında gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu (p>0,05) (Şekil 1 ve 2). Sütürasyonlara bağlı keratit veya başka bir komplikasyon izlenmedi.

Ortalama KNV regresyon oranları bevacizumab ve biyobenzer gruplarında, kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksekti (kontrol grubu: %24,6±3,9 bevacizumab grubu: %82,2±3,0 biyobenzer grubu: %83,4±3,8; p<0,05). Bevacizumab ve biyobenzer grupları arasında KNV regresyon oranları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark izlenmedi (p>0,05) (Şekil 1 ve 3). Hematoksilen-eozin boyamada, kontrol grubunda çok sayıda damar izlenirken bevacizumab ve biyobenzer gruplarında neredeyse hiç damar görülmedi (Şekil 4). CD31 ile boyamanın yetersiz olması nedeniyle immünohistokimyasal değerlendirme yapılamadı.

Tartışma

Biyobenzer terimi, biyolojik ajanlara çok benzeyen ancak etkinlik, güvenlik ve saflık açısından aynı olmayan maddeler için kullanılır. Biyobenzer ilaçların yaygınlaşması, ilaç maliyetlerini düşürmekte ve hastaların ilaçlara ulaşmasını kolaylaştırmaktadır. Biyobenzer ilaçların üretimi karmaşık bir süreçtir. Üretim sürecindeki küçük yapısal farklar ilacın etkinliğinde ve güvenliğinde önemli değişikliklere neden olabilmektedir.⁹ Çalışmamızda, immünoloji laboratuvarımızda üretilen bevacizumabın potansiyel biyobenzeri anti-human VEGF GU01’in deneysel KNV modeli üzerindeki etkisini araştırdık.¹¹

Bevacizumabın oküler kullanımlar için üretilmiş formları bulunmamaktadır. İlacın oküler kullanım için hazırlama süreçleri ülkeden ülkeye farklılıklar göstermektedir. İlaç, ticari olarak 4 mL veya 16 mL’lik tek şişelerde bulunmaktadır. Oküler kullanım için gereken küçük dozlar enjektörlerle hazırlanmaktadır. Bu hazırlama aşamalarının kişiye bağımlı olması ilacı kontaminasyon açısından riskli kılmaktadır. Dünyanın farklı bölgelerinde bevacizumaba bağlı ağır endoftalmi ve görme kaybı olguları bildirilmiştir.^{12, 13, 14}

1998’de Yatoh ve ark.¹⁵ VEGF inhibisyonunun farelerde greft sağkalımının uzamasını sağladığını göstermesiyle beraber bevacizumabın KNV üzerine olan etkisiyle ilgili birçok deneysel ve klinik çalışma yapılmaya başlanmıştır. Deneysel çalışmalar genellikle sütürle oluşturulan KNV modelleriyle yapılmıştır. Bu modellerde oluşturulan KNV, hem patofizyolojik açıdan hem de görünüm olarak insanlarda gelişen KNV ile daha uyumludur.^{16, 17}Biz de bu bilgiler ışığında çalışmamızda sütür ile oluşturulmuş KNV modelini kullandık.

KNV’nin ne kadar süredir var olduğu tedavinin seçiminde önemli bir faktördür. Aktif damar oluşumu sırasında yani KNV’nin yeni geliştiği aşamalarda tıbbi tedavi daha etkili olabiliyorken; olgun damarların geliştiği yani KNV’nin kronikleştiği aşamalarda ince iğne diatermi gibi cerrahi müdahalelerin daha etkili olduğu gösterilmiştir.^{18, 19} Bu farklılığın oluşmasında KNV geliştikten hemen sonraki iki hafta içinde damarların farmakolojik ajanlara duyarlılığını azaltan perisitler tarafından kaplanmasının önemli bir faktör olduğu düşünülmektedir.⁵ Lin ve ark.¹⁸, yaptığı bir çalışmada KNV tedavisinde anti-VEGF tedavinin zamanlamasını incelemişlerdir. Çalışmada erken dönemde başlanan anti-VEGF tedavinin fayda sağladığı izlenirken, geç dönemde başlanan anti-VEGF tedavinin ise KNV’yi geriletici etkisinin olmadığı gösterilmiştir. Biz de çalışmamızda erken dönemde tedavilerimizi uyguladık. Sonuçlara baktığımızda hem bevacizumab hem de anti-human VEGF GU01 enjekte edilen gruplarda, 14. günde KNV alanlarının %80’den fazlasının gerilemiş olduğunu gözlemledik.

Çalışmamızda sütürle indüklenen KNV modeli tercih edilmiştir çünkü bu model hem oluşturulması kolay hem de insanlardaki KNV patofizyolojisi ile yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Ancak klinikte özellikle kimyasal yanık ve limbal kök hücre yetmezliği gibi durumlar daha agresif ve kalıcı neovaskülarizasyonlar izlenebilmektedir. Bu nedenle anti-human VEGF GU01’in bu tür zorlu modellerde de etkinliğinin değerlendirilmesi, ilacın gerçek klinik potansiyelini ortaya koyması açısından önemli olabilir.¹⁷

KNV tedavisinde bevacizumabın subkonjonktival uygulamasının dozu ve sıklığı konusunda bir fikir birliği bulunmamaktadır. Yirmi dört hastalık bir çalışmada, 2,5 ve 5 mg subkonjonktival bevacizumabın tek doz uygulamasının KNV gerilemesi üzerinde benzer şekilde etkili olduğu bulunmuştur.²⁰ Yüz sıçanı içeren başka bir deneysel çalışmada, 1 mg, 5 mg ve 25 mg subkonjonktival bevacizumabın KNV tedavisindeki etkisinin benzer olduğu bulunmuştur.²¹ Biz de çalışmamızda ilaç dozunu 2,5 mg olarak uyguladık. Subkonjonktival bevacizumabın yarı ömrünün tavşanlarda 1,8-2,8 hafta arasında gösterilmiş olması sebebiyle çalışmamızda enjeksiyonları tekrarlamadık.²²

Kornea naklinin tüm organ nakilleri arasında %90’lık bir başarı oranıyla en başarılı yöntem olduğu gösterilmiştir.²³ Ancak cerrahi enflame veya vaskülarize bir alıcı yatakta gerçekleştirildiğinde bu başarı oranı %20-40’lara düşebilmektedir.²⁴ Bevacizumab KNV tedavisinde en sık kullanılan anti-VEGF ajanlarından biridir. Dekaris ve ark.²⁵, ameliyat için yüksek riskli kabul edilen 50 gözde penetran keratoplasti sonrası greft sağkalımına faydasını değerlendirmek için ameliyat sonrası 0,5 mL/25 mg subkonjonktival ve 25 mg/mL topikal bevacizumab kullanmışlardır. Çalışmada üç yıllık takip sonrası hastaların %70’inde greft saydamlığının korunduğu tespit edilmiştir.

KNV’de yalnızca pro-anjiyojenik büyüme faktörlerinin artışı değil, aynı zamanda ekstrasellüler matriksin yeniden şekillenmesi de önemli rol oynamaktadır. Bu süreçte matriks metalloproteinazlar (MMP), özellikle MMP-2 ve MMP-9, bazal membran ve stromal yapıyı yıkarak yeni damarların invazyonunu kolaylaştırmaktadır. Enflamatuvar hücreler ve aktive olmuş epitel/stromal hücreler tarafından salgılanan bu enzimler, VEGF gibi anjiyojenik faktörlerin etkisini potansiyel olarak artırmakta ve damarlanmanın ilerlemesini desteklemektedir. Çalışmamızda MMP düzeyleri doğrudan değerlendirilmemiş olmakla birlikte, biyobenzer VEGF inhibitörünün neovaskülarizasyonu baskılaması, dolaylı olarak MMP aktivitesinin de azalmış olabileceğini düşündürmektedir.^{26, 27}

Çalışmanın Kısıtlılıkları

Bu çalışmanın önemli sınırlılıklarından biri, deney gruplarında yer alan hayvan sayısının az olmasıdır. Grup başına beşer hayvan ile çalışılmış olması, elde edilen sonuçların istatistiksel gücünü ve genellenebilirliğini kısıtlayabilir. Çalışma sonrası yaptığımız güç analizinde yeterli güç elde edilmiş olsa da (>%95), daha büyük örneklemli ileri faz deneysel ve klinik çalışmalar anti human VEGF GU01’in etkinliğini daha kuvvetli değerlendirebilir. Çalışmamızın diğer kısıtlılıklarından biri, korneal damarlanmanın immünohistokimyasal düzeyde değerlendirilmesi amacıyla kullanılan CD31 antikoru ile yapılan boyamanın başarısızlıkla sonuçlanmasıdır. Bu durumun olası nedenlerinden biri, CD31 antikorunun taşınması veya saklanması sırasında soğuk zincirin bozulmuş olmasıdır. CD31 gibi sıcaklığa duyarlı antikorların biyolojik aktivitesinin korunabilmesi için 2-8 °C aralığında sabit sıcaklıkta saklanması gerekmektedir. Soğuk zincirdeki herhangi bir aksama, antikorun hedef antijene bağlanma kapasitesini azaltarak boyama sonucunu olumsuz yönde etkileyebilir. Bu nedenle çalışmamızda immünohistokimyasal analiz yapılamamış, sadece klinik ve histopatolojik değerlendirme ile sonuçlara ulaşılmıştır. Gelecek çalışmalarda bu teknik sorun dikkate alınarak, CD31’in yanı sıra CD34 veya von Willebrand faktörü gibi alternatif damar endotel belirteçlerinin kullanılması gündeme gelebilir. Çalışmayı güçlendirecek proanjiojenik ve anjioyenik molekülleri düzeylerine bakılmaması çalışmanın diğer kısıtlıklarıdır.

Sonuç

Sonuç olarak, bu bilgiler ışığında bevacizumabın kornea nakli ameliyatlarında kullanımının yaygınlaşmasının cerrahi başarıyı artıracağını düşünmekteyiz. Faz çalışmaları tamamlandığında, bevacizumabın potansiyel bir biyobenzeri olan anti-human VEGF GU01 de yüksek riskli penetran keratoplastilerde cerrahi başarı oranlarını artırma potansiyeli bulunmaktadır. Bu deneysel çalışmada, literatürde ilk olarak, anti-human VEGF GU01’in subkonjonktival uygulaması yapılmıştır.